Ekstraksi

 

Ekstrasi merupakan metode purifikasi DNA yang bertujuan untuk memisahkan DNA dengan membrane sel, protein, serta komponen sel lainnya sehingga didapatkan hasil DNA yang murni (pure). Ekstraksi DNA dapat dilakukan secara fisik seperti contohnya melakukan proses pencacahan DNA dengan bantuan scalpel ataupun gunting. Selain fisik proses ekstrasi juga dapat dilakukan dengan bantuan zat kimia seperti contonya buffer dan ethanol. Proses ekstraksi DNA secara umum terdiri atas 3 tahapan, diantaranya lisis, presipitasi, serta purifikasi.

a)  Tahap Lisis

Tujuan dari tahap ini adalah untuk memecah sel dan mengeluarkan DNA dari dalam nukleus. Pada tahap ini dilakukan proses perusakana dinding sel DNA. Tahap ini biasanya dilakukan dengan proses pencacahan sampel dengan bantuan cawan petridish, scalpel, gunting serta pinset. Sampel akan diletakan diatas petridish

kemudian dipotong dengan bantuan gunting lalu proses pencacahan dapat dimulai dengan bantuan scalpel serta pinset. Pada salah satu metode ekstraksi seperti contohnya metode ekstraksi chelex, menggunakan resin chelex untuk membantu proses lisis. Sedangkan pada metode lainnya menggunakan senyawa kimia seperti buffer ATL serta proteinase K untuk membantu proses lisis.

b)    Tahap Presipitasi

Tahap ini bertujuan untuk memisahkan DNA dari debris seluler lainnya seperti protein, lipid, polisakarida, komponen organik dan dan anorganik. Pada salah satu metode ketraksi seperti contohnya ektraksi dengan metode Qiagen, proses ini dilakukan dengan penambahan buffer AL serta ethanol yang berfungsi untuk mengikat DNA sehingga tidak tercampur dengan debris lainnya. Selanjutnya dilakukan proses filtrasi dengan memindahkan supernatan kedalam minispin coloumn yang mana pada minispin coloumn tersebut terdapat filter yang berfungsi untuk memfiltrasi DNA sehingga terpisah dari debris lainnya.

 

c)     Tahap Purifikasi

Setelah DNA terpresipitasi, kemudian dilanjutkan dengan pencucian DNA. Pada metode ekstraksi Qiagen, pencucian DNA dilakukan dengan melakukan penambahan buffer seperti Bufffer AW 1 dan Buffer AW 2 yang mana kedua buffer tersebut merupakan wash buffer yang fungsinya untuk mencuci DNA serta memastikan bahwa DNA tersebut bersih dari debris lain yang tidak diperlukan. Kemudian diakhir dilakukan penambahan double distilled water (ddH20), ddH20 akan berinteraksi dengan DNA sehingga menyebabkan DNA terdenaturasi yang mana hal tersebut dapat mencegah terjadinya kerusakan DNA.

Suatu metode diaplikasikan berdasarkan karakteristik sample yang didapat, berdasarkan referensi dari berbagai literatur serta pengalaman yang pernah dilakukan. Di BIONESIA sendiri terdapat beberapa metode ekstraksi yang sering dilakukan antara lain sebagai berikut.

a.     Metode Ekstraksi Chelex 10%

Sesuai dengan namanya, metode ini menggunakan bantuan resin chelex dalam proses ekstraksi DNA. Resin chelex merupakan copolymer styrene- divinylbenzene yang berfungsi untuk mengikat ion-ion yang berperan sebagai cofactor untuk DNases (Deoxyribonuclease) dengan ion iminodiacetic yang

dimilikinya. Chelex juga merupakan resin yang stabil pada seluruh rentang pH. Resin chelex aktif secara fungsional pada rentang pH 2-14 Dalam metode ini terdapat proses pemanasan (inkubasi) didalam heating block, pada proses pemanasan tersebut resin chelex akan mengikat ion dan kation yang terlarut dalam larutan resin, termasuk juga ion Mg²⁺. Dengan pengikatan tersebut, resin chelex membuat DNase tidak bereaksi sehingga DNA terlindungi dari aktivitas enzim tersebut. Metode ekstraksi Chelex 10% merupakan metode ekstraksi yang disukai karena cepat, tidak memerlukan beberapa kali pemindahan tabung dan tidak menggunakan pelarut organik beracun seperti fenol-kloroform.

Metode ekstraksi dengan chelex 10 % diawali dengan pembuatan chelex itu sendiri. Untuk membuat chelex 10 % diperlukan campuran 50 ml double distilled water (ddH₂0) dan 5 gr resin chelex. Kedua bahan tersebut kemudian dihomogenkan dengan bantuan magnetic strirer, setelah itu chelex akan dipindahkan kedalam tube kecil sejumlah 250 ul. Chelex yang sudah dipidahkan kedalam tube-tube kecil harus dipindahkan kedalam lemari pendingin (kulkas) serta pastikan kondisi didalam lemari pendingin tersebut steril untuk mencegah terjadinya kontaminasi.

Dalam praktiknya ketika pelaksanaa ekstraksi, setelah dilakukan pencacahan, sample kemudian dimasukkan kedalam resin chelex yang telah dibuat sebelumnya. Sampel yang dimasukkan kedalam resin chelex kurang lebih sebanyak setengah butir beras. Pada saat memasukkan sample, pastikan agar benar-benar tenggelam didalam resin (tidak melayang pada bagian supernatant) karena resin inilah yang akan membantu proses pelilisan sample dengan bantuan proses pemanasan.

b.     Metode Ekstraksi Kit Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kits

Metode ini merupakan metode ekstraksi berbasis silika yang cepat dan mudah tanpa menggunakan fenol atau kloroform dalam format spin- coloumn. Metode ekstraksi Qiagen dapat diaplikasikan utuk berbagai macam jenis sampel seperti jaringan dan sel hewan segar atau beku, darah, atau bakteri. Seperti metode ekstraksi lainnya, pada metode

ekstraksi dengan Kit Qiagen juga terdiri atas beberapa tahap yaitu tahap lisis, tahap presipitasi, serta tahap purifikasi.

Tahap lisis dilakukan dengan melakukan pencacahan sampel hingga mendapatkan sampel sebanya kurang lebih 0,1 ml yang kemudian dimasukkan kedalam tube. Tahap lisis juga dibantu oleh penggunaan buffer ATL yang merupakan sebuah lisis buffer yang berfungsi untuk melisiskan jaringan. Selain itu tahap lisis juga dibantu oleh proteinase-k yang membantu terjadinya proses pemecahan komponen protein sel serta memungkinkan akses ke DNA. Pada tahap lisis juga dilakukan proses pemanasan di dalam heating block selama 2-3 jam (tergantung karakteristik sampel) dalam suhu 56^oC.

Setelah sampel lisis, kemudian dilanjutkan ke tahap presipitasi. Pada tahap ini terdapat penambahan buffer AL serta ethanol yang berfungsi untuk mengikat DNA agar terpisah dari debris lain yang tidak diperlukan. Setelah dilakukan penambahan buffer AL serta ethanol, kemudian dilakukan proses vortex dan centrifugasi yang bertujuan untuk mencapurkan sample dengan buffer AL serta ethanol serta mengendapakan sampel.

Selanjutnya merupakan tahap purifikasi, pada tahap ini dilakukan dengan melakukan filtrasi pada DNA dengan bantuan DNeasy mini spin coloumn. Selain proses filtrasi dengan DNeasy mini spin coloumn, proses purifikasi juga dilakukan bantuan wash buffer yaitu buffer AW1 serta buffer AW2 yang dimasukkan sebanyak masing-masing 500 ul. Wash buffer digunakan untuk melakukan pembilasan pada bagian jaringan setelah dilakukan tahapan inkubasi sebelumnya, wash buffer membantu menghilangkan regaen sebelumhya dan menyiapkan jaringan untuk aplikasi reagen berikutnya. Setelah dilakukan purifikasi dengan wash buffer, kemudian dilanjutkan dengan penambahan double distilled water (ddH2O). Setelah melakukan penambahan ddH₂O kemudian dilakukan inkubasi selama kurang lebih 1 menit di suhu ruang. Hasil ekstraksi dapat disimpan didalam lemari pendingin sebelum dilanjutkan ke proses PCR.

c.     Metode Ekstraksi Genomic

Metode ekstraksi Genomic dirancang untuk memurnikan DNA total (termasuk genom, mitokondria, serta DNA virus) dari berbagai sampel jaringan. Metode ekstraksi genomic memiliki prinsip yang mirip dengan metode ekstraksi dengan Kit Qiagen karena terdapat proses filtrasi dengan bantuan filter serta penggunaan beberapa buffer didalamnya.

Pada pengaplikasiannya, proses ekstraksi dengan metode genomic diawali dengan melakukan Tissue dissociation yang mana pada tahap ini dilakukan proses pencacahan sampel secara manual dengan bantuan scalpel, gunting, ataupun pinset. Tahap ini juga dibantu oleh penggunaan lisis buffer yaitu GT buffer sebanyak 200 ul serta Proteinase-k sebanyak 20 ul. Selanjutnya, dilanjutkan dengan proses pemanasan yang dilakukan didalam mesin inkubasi atau heating block. Suhu yang diperlukan untuk pemanasan adalah 60^oC selama kurang lebih 30 menit. Untuk mempercepat serta memastikan sample agar benar-benar lisis dilakukan vortex dan centrifugasi terhadap sampel setiap 5 menit selama masa inkubasi.

Setelah 30 menit, kemudian masukkan 200 ul GBT buffer kedalam sampel lalu campurkan dengan bantuan vortex, lakukan inkubasi kembali selama 30 menit dalam suhu 60^oC. Setelah 30 menit, masukkan ethanol absolut sebanyak 200 ul, lalu lakukan inkubasi kembali selama 10 menit dalam suhu 60^oC. Siapkan pula elution buffer untuk diinkubasi bersama sampel didalam heating block.

Selanjutnya merupakan tahap presipitasi (binding). Pada tahap ini, siapkan Gs coloumn serta collection tube berukuran 2 ml lalu pindahkan semua supernatan dari tube sampel kedalam Gs coloumn dengan bantuan micropipette. Centrifuge denga kecepatan 14.000 rpm selama 2 menit untuk memastikan semua supernatan berkumpul pada collection tube. Supernatan yang telah tertampung didalam collection tube selanjutnya dapat dibuang karena tidak dipergunakan lagi.

Selanjutnya merupakan tahap purifikasi, tahap dilakukan dengan mengguanakan beberapa buffer yang berfungsi untuk menghilangkan debris yang tidak diperlukan dalam proses ekstraksi. Tahap ini diawali dengan menambahkan 400ul buffer W1 kedalam Gs coloumn yang kemudian dilanjutkan dengan tahap vortex dan centrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 30 detik. Karena bagian supernatan yang telah tertampung didalam collection tube tidak digunakan lagi, collection tube tersebut dapat dibuang lalu diganti dengan collection tube baru. Selanjutnya, masukkan 600 ul Wash buffer lalu dilanjutkan dengan vortex dan centrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 30 detik.

Collection tube dapat dibuang, Gs coloumn dapat ditempatkan kedalam tube baru berukuran 1,5 ml. Proses selanjutnya adalah memasukkan elution buffer (EB) sejumlah 50 ul, proses ini dilakukan sebanyak 2 kali yaitu tahap pertama yang mana diakhir setiap tahap tersebut dilakuka proses centrifugasi pada kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit kemudian inkubasi dalam suhu 60^oC selama 25 menit.