Polymerase Chain Reaction (PCR)

 

Polymerase Chain Reaction merupakan suatu teknis sintesis dan amplifikasi DNA. Teknik ini dpaat digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa jam. PCR melibatkan tiga tahap siklus temeperatur yang berurutan yaitu denaturasi template (94- 95^oC), annealing (penempelan) pasangan primer untai ganda DNA target (50 - 60^oC) dan pemanjangan (72^oC) (Setyawati & Zubaidah, 2021). Faktor-faktor yang memengaruhi keberhasilan PCR diantaranya adalah konsentrasi dan kualitas DNA, temperature annealing dari kedua primer, konsentrasi dan kualitas primer jumlah siklus PCR, jumlah siklus PCR, deoksiribonukleotida- triphosphate (dNTP), dan faktor lain seperti larutan buffer (Gelfand and White, 1990).

Dalam praktiknya, selama melaksanakan kegiatan magang di BIONESIA terdapat beberapa jenis protocol PCR yang dipraktikkan diantaranya Hot Start, Bioline, Bioline HS, serta Kapa. Beberapa bahan yang diperlukan dalam PCR adalah DNA template atau sampel hasil ekstraksi, double distilled water (ddH2O), primer, MgCl₂, dNTP, serta Enzim. Namun ada beberapa protokol PCR yang menggunakan rady mix, Dimana didalam ready mix tersebut sudah tercampur antara MgCl₂, dNTP, serta Enzim sehingga kita hanya perlu menambahkan double distilled water (ddH2O), primer serta DNA template.

A.     PCR Hot Start

Hot Start merupakan suatu teknik yang bekerja dalam menghambat aktivitas Hot Start Taq polymerase atau penggabungan dNTP yang dimodifikasi selama pengaturan reaksi hingga langkah aktivasi pada terjadi. Hot start memungkinkan terjadinya pengaturan rekasi pada suhu ruang tanpa amplifikasi non-spesifik dan pembentukan primer dimer.

Pelaksanaan PCR Hot Start diawali dengan pengisian form Hot Start yang bertujuan untuk mengetahui berapa takaran bahan yang harus dimasukkan kedalam tube, membersihkan meja kerja, menyiapkan microtube rack serta pcr tray yang berfungsi untuk menempatkan tube. Selanjutnya kita juga perlu menyiapkan bahan, Adapun bahan yang diperlukan dalam PCR Hot Start yaitu sampel hasil ekstraksi, ddH20, dNTPs, MgCl2, primer, serta PE Amplitaq. Tahap selanjutnya adalah mempersiapkan master mix, Beberapa bahan yang digunakan dalam pembuatan master mix adalah ddH2O,10x PCR Buffer (PE-II), dNTPs, MgCl₂, primer (reverse & forward), serta PE Amplitaq. Didalam PCR Hot Start sendiri kita perlu menyiapkan 2 jenis master mix yaitu master mix I dan master mix 2. Dalam pembuatan master mix I kita perlu memasukkan ddH₂0, 10x PCR Buffer (PE-II), dNTPs, MgCl₂, serta Primer (reverse & forward) kedalam tube Master Mix (Micro centrifuge tube) dengan bantuan micropitte. Pastikan volume bahan yang masuk sesuai dengan jumlah yang tertera pada form. Setelah itu Vortex Master mix dalam waktu 10-15 detik, kemudian centrifuge dengan kecepatan 8000 rpm selama 10 detik. Sedangkan dalam pembuatan master mix 2 kita perlu memasukkan ddH20 serta 10x PCR Buffer (PE-II), kedalam tube Master Mix (Micro centrifuge tube) dengan bantuan

micropitte. Pastikan volume bahan yang masuk sesuai dengan jumlah yang tertera pada form. Kemudian Vortex master mix dalam waktu 10-15 detik, kemudian centrifuge dengan kecepatan 800 rpm selama 10 detik. Masukkan PE Amplitaq kedalam tube Master Mix 2 sesuai dengan volume yang tertera pada form.

Selanjutnya, masukkan master mix 1 yang telah dibuat sebelumnya kedalam strip tube sesuai dengan volume yang tertera dalam form. Kemudian, Masukkan sampel atau DNA template kedalam strip tube yang telah diisi master mix 1 sesuai dengan jumlah template yang diperlukan lalu lakukan centrifugasi didalam minicentrifuge selama 10-15 detik, kemudian strip tube dapat dimasukkan kedalam mesin thermocycler. Setting mesin sesuai dengan protokol yang digunakan, pastikan annealing yang tertera sesuai dengan protokol. Pilih start pada mesin, lalu tunggu hingga suhu mencapai 80 derajat celcius. Setelah mencapai suhu 80 derajat celcius pilih menu pause, lalu buka penutup pada mesin thermocycler. Masukkan Master Mix 2 kedalam strip tube dengan bantuan micropipette. Setelah Master Mix 2 masuk kedalam semua strip tube, proses running dapat dilanjutkan kembali. Dalam memasukkan master mix 2 usahakan dilakukan dengan cepat karena waktu pause hanya berlangsung selama  10 menit. Setelah master mix 2 telah dimasukkan kedalam semua strip tube kemudian proses running dapat dilanjutkan.

B.     PCR Bioline, Bioline HS, dan Kapa

Protokol kerja PCR Bioline, Bioline HS, serta Kapa relative lebih sederhana dari PCR Hot Start, karena terdapat penggunaan master mix didalamnya. Secara umum, proses pengerjaan PCR dengan PCR Bioline, Bioline HS serta Kapa juga sama hanya saja yang membedakan adalah ready mix yang digunakan (Bioline, Bioline HS, serta Kapa.

Beberapa bahan yang diperlukan dalam proses pengerjaan PCR Bioline, Bioline HS, serta Kapa antara lain DNA template, double distiled water (ddH2O), Primer (reverse & forward), serta ready mix (Bioline, Bioline HS, Kapa). Proses pengerjaan PCR Bioline, Bioline HS, serta Kapa dimulai dengan pengisian form terlebih dahulu agar kita mengetahui jumlah bahan yang akan dimasukkan kedalam tube master mix. Sebelum mulai ke tahap selanjutnya ada baiknya kita membersihkan meja kerja terlebih dahulu. Membersihkan meja kerja dilakukan dengan bantuan bleach 10 %.

Langkah selanjutnya, ambil bahan-bahan yang diperlukan seperti ddH20, primer, serta ready mix didalam freezer kemudia letakkan pada Microtube rack. Langkah selanjutnya ialah pembuatan master mix, yang mana master mix ini merupakan campuran beberapa bahan pendukung PCR. Hal yang harus dilakukan dalam pembuatan master mix adalah memasukkan ddH₂0, Primer (reverse & forward) serta ready mix kedalam tube Master Mix (Micro centrifuge tube) dengan bantuan micropitte. Pastikan volume bahan yang masuk sesuai dengan jumlah yang tertera pada form.

Vortex Master mix dalam waktu 10-15 detik, kemudian centrifuge dengan kecepatan 8000 rpm selama 10 detik. Selanjutnya, masukkan master mix yang telah dibuat sebelumnya kedalam strip tube sesuai dengan volume yang tertera dalam form lalu masukkan pula DNA template sesuai dengan jumlah yang tertera pada form. Setelah semua sampel dimasukkan kedalam strip tube, kemudian centrifuge sampel didalam minicentrifuge selama 10-15 detik. Terakhir, proses running dapat dijalankan dengan memasukkan strip tube kedalam mesin thermocycler. Setting mesin sesuai dengan protokol yang digunakan, pastikan annealing yang tertera sesuai dengan protokol.