Elektroforesis

 

        

Elektroforesis merupakan tahapan selanjutnya setelah dilakukan proses PCR. Tahapan ini membantu peneliti dalam hal visualisasi serta pemetaan DNA. Secara umum prinsip kerja elektroforesis adalah pemisahan molekul DNA berdasarkan ukuran atau konformasinya. Proses pemisahan molekul DNA pada proses elektroforesis dibantu oleh adanya medan listrik, serta buffer. Berdasarkan ada atau tidaknya media penunjang didalamnya, elektroforesis dibedakan menjadi dua tipe yaitu zone elektroforesis serta moving boundary elektroforesis. Zone elektroforesis merupakan suatu teknik elektroforesis dimana didalamnya melibatkan media pendukung seperti contohnya filter paper serta agarose gel. Sedangkan moving boundary elektroforesis merupakan teknik elektroforesis yang tidak melibatkan media pendukung didalamnya.

Teknik elektroforesis yang digunakan di BIONESIA sendiri adalah zone elektroforesis dengan agarose gelsebagai media pendukungnya atau sering disebut sebagai agarose gel electrophoresis. Agarose gel electrophoresis merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memisahkan populasi campuran makromolekul dalam matriks agarose. Didalam agarose gel terdapat lekukan atau sering disebut sebagai sumur atau well yang berfungsi sebagai tempat memasukkann (load) sample. Agarose gel juga memiliki pore atau pori yang akan dilewati oleh sample saat proses running elektroforesis berlangsung.

Elektrofhoresis chamber atau tangka elektroforesis merupakan sebuah alat yang diguankana untuk membantu proses elektroforesis, alat ini digunakan untuk menempatkan buffer yang berfungsi untuk mempertahankan pH didalam medium pemisahan, serta agarose gel. Elektrophoresis chamber juga dilengkapi dengan elektroda positif (anoda) serta elektroda negatif (anoda) yang mana elektroda berfungsi untuk menghantarkan arus listrik untuk membantu pemisahan DNA. Pemisahan DNA terjadi karena adanya mutana negative pada DNA oleh karena itu DNA akan bergerak kearah yang berlawanan yaitu kutub positif atau anoda melalui pore atau pori yang terdapat pada matriks agarose. Kecepatan pergerakan DNA ditentukan oleh ukuran molekulnya, molekul dengan ukuran besar akan bergergerak lebih lambat daripada molekul berukuran kecil.

Dalam prosesnya, secara umum agarose gel electrophoresis terdiri atas tiga tahapan utama yaitu proses pembuatan agarose gel, proses running sample oleh bantuan medan listrik serta buffer, serta visualisasi yang dibantu oleh mesin UV transilluminator. Agarose gel juga memerlukan bantuan beberapa reagen dalam proses pengerjaannya, beberapa reagen tersebut antara lain sebagai berikut.

1)      Loading Dye

Merupakan reagen yang tersusun atas bromophenol blue yang berfungsi untuk memberikan warna biru pada loading dye, xylene cyanol yang berfungsi untuk membantu memantau pergerakan sampel, serta gliserol yang berfungsi sebagai pemberat agar ketika dimasukkan kedalam matriks agarose gel sampel tidak akan tercampur dengan buffer.

DNA Stain

DNA stain merupakan suatu reagen yang digunakan dalam proses pewarnaan DNA agar dapat divisualisasikan didalam mesin UV transilluminator. Jenis DNA stain yang digunakan di BIONESIA sendiri adalah Biotium Gel Red, biotium merupakan pewarna fluorescent asa nukleat yang sangat sensitive, sangat stabil, dan aman bagi lingkungan. Biotium bekerja dengan cara melakukan interkalasi diantara pasangan basa.

2)      Ladder

Ladder merupakan kombinasi berbagai molekul dsDNA dengan ukuran tertentu yang digunakan sebagai acuan selama proses elektroforesis. Ladder berfungsi untuk memperkirakan ukuran molekul protein selama proses elektroforesis berlangsung.

3)      Buffer

Larutan buffer berfungsi untuk mempertahanakan pH didala medium pemisah, buffer juga berfungsi sebagai media penyedia elektrolit pada proses pergerakan aliran listrik. Buffer yang digunakan saat ini di BIONESIA untuk menunjang proses elektroforesis ialah Sodium Borate Buffer. Sodium Borate Buffer (SB Buffer) merupakan larutan penyangga yang komposisinya terdiri atas Boric Acid serta Natrium Hidroksida. SB buffer memiliki konduktivitas yang cenderung rendah sehingga dapat dijalankan pada kecepatan yang lebih tinggi.

Keunggulan agarose gel electrophoresis adalah penggunaan media gel yang tidak beracun, pembuatan gel yang mudah dan cepat, serta pemisahan molekul yang mudah. Sedangkan kelemahan agarose gel adalah dapat meleleh atau melting sehingga menghasilkan bentuk yang tidak diinginkan seperti “smiley gel” yang dapat mengakibatkan kesalahan dalam identifikasi.