Pembuatan gel

 



    Elektroforesis ialah proses migrasi molekul bermuatan dalam medium yang dialiri arus listrik (Hartati, 2007). Menurut Russel (1994), bahwa prinsip dasar elektroforesis adalah molekul dan partikel bermuatan akan bergerak ke arah elektrode yang memiliki muatan berlawanan di bawah pengaruh medan listrik. Laju migrasi molekul bermuatan tersebut menuju elektrode yang bermuatan negatif disebut elektromobilitas. Prinsip kerja dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium bertenaga listrik. Molekul-molekul akan bermigrasi menuju kutub positif atau negatif berdasarkan muatan yang terdapat didalamnya. Molekul di dalam DNA bermuatan negatif, molekul tersebut akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (Magdeldin, 2012). Sulaiman (2007) mengemukakan beberapa faktor yang mempengaruhi migration rate elektroforesis selama DNA bergerak menembus gel agarose, yaitu sebagai berikut:
  1. Ukuran molekul DNA Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat, missal DNA linier lebih cepat dibanding DNA sirkuler. Jarak migrasi molekul DNA pada gel adalah laju terbalik proporsional log-10 dari jumlah pasangan basa.
  2. Konsentrasi DNA, Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan berberak sesuai dengan konsentrasi dari gel agarose yang digunakan. Rumusnya adalah: logu = log o - KrT dimana uo adalah free electrophoresis mobility, Kr adalah retardation coefficient, dan T adalah gel konsentrasi serta u adalah electrophoretic mobility DNA
  3. Konformasi DNA, Laju migrasi juga tergantung pada bentuk atau konformasi DNA, kita tahu bahwa ada 3 macam bentuk DNA yaitu super-helix circular (I), circular-opened (II), dan linier (III). Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. 
  4. Penggunaan Voltage dan arah dari bidang elektris Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional. Idealnya untuk DNA 2kb pada gel agarose bergerak  5v/cm. Arah dari bidang elektris konstans untuk DNA 50-100kb bergerak dengan laju yang sama, akan berubah secara periodik sesuai kecepatan pergerakan DNA akan berubah juga.
  5. Komposisi basa DNA atau temperatur Baik komposisi basa maupun temperature tidak begitu berpengaruh, mobilitas DNA stabil pada suhu 4-30 oC dan elektroforesis gel agarose dilakukan pada suhu kamar.
  6. Keberadaan pewarna DNA Iintercalating agent Ethidium Bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresence untuk deteksi asam nukleat, EtBr ini akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. EtBr dapat mengurangi mobilitas DNA linier sampai 15%. Hanya sedikit DNA 1ng dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV- transilluminator. EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single atau double- stranded asam nukleat (DNA atau RNA).

Comments

Post a Comment

Popular posts from this blog

Elektroforesis

Image
           Elektroforesis merupakan tahapan selanjutnya setelah dilakukan proses PCR. Tahapan ini membantu peneliti dalam hal visualisasi serta pemetaan DNA. Secara umum prinsip kerja elektroforesis adalah pemisahan molekul DNA berdasarkan ukuran atau konformasinya. Proses pemisahan molekul DNA pada proses elektroforesis dibantu oleh adanya medan listrik, serta buffer.  Berdasarkan ada atau tidaknya media penunjang didalamnya, elektroforesis dibedakan menjadi dua tipe yaitu zone elektroforesis serta moving boundary elektroforesis. Zone elektroforesis merupakan suatu teknik elektroforesis dimana didalamnya melibatkan media pendukung seperti contohnya filter paper serta agarose gel . Sedangkan moving boundary elektroforesis merupakan teknik elektroforesis yang tidak melibatkan media pendukung didalamnya. Teknik elektroforesis yang digunakan di BIONESIA sendiri adalah zone elektroforesis dengan agarose gelsebaga...
Read more

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Image
  Polymerase Chain Reaction merupakan suatu teknis sintesis dan amplifikasi DNA. Teknik ini dpaat digunakan untuk mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa jam. PCR melibatkan tiga tahap siklus temeperatur yang berurutan yaitu denaturasi template (94- 95 o C), annealing (penempelan) pasangan primer untai ganda DNA target (50 - 60 o C) dan pemanjangan (72 o C) (Setyawati & Zubaidah, 2021). Faktor-faktor yang memengaruhi keberhasilan PCR diantaranya adalah konsentrasi dan kualitas DNA, temperature annealing dari kedua primer, konsentrasi dan kualitas primer jumlah siklus PCR, jumlah siklus PCR, deoksiribonukleotida- triphosphate (dNTP), dan faktor lain seperti larutan buffer (Gelfand and White, 1990). Dalam praktiknya, selama melaksanakan kegiatan magang di BIONESIA terdapat beberapa jenis protocol PCR yang dipraktikkan diantaranya Hot Start, Bioline, Bioline...
Read more

Ekstraksi

Image
  Ekstrasi merupakan metode purifikasi DNA yang bertujuan untuk memisahkan DNA dengan membrane sel, protein, serta komponen sel lainnya sehingga didapatkan hasil DNA yang murni ( pure ). Ekstraksi DNA dapat dilakukan secara fisik seperti contohnya melakukan proses pencacahan DNA dengan bantuan scalpel ataupun gunting. Selain fisik proses ekstrasi juga dapat dilakukan dengan bantuan zat kimia seperti contonya buffer dan ethanol. Proses ekstraksi DNA secara umum terdiri atas 3 tahapan, diantaranya lisis, presipitasi, serta purifikasi. a)   Tahap Lisis Tujuan dari tahap ini adalah untuk memecah sel dan mengeluarkan DNA dari dalam nukleus. Pada tahap ini dilakukan proses perusakana dinding sel DNA. Tahap ini biasanya dilakukan dengan proses pencacahan sampel dengan bantuan cawan petridish, scalpel, gunting serta pinset. Sampel akan diletakan diatas petridish kemudian dipotong dengan bant...
Read more